పరమాణు నిర్ధారణ, సాధారణంగా ఉపయోగించే PCR సాంకేతికత మరియు సూత్రం

PCR, పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్, ఇది DNA పాలిమరేస్ ఉత్ప్రేరకము క్రింద సిస్టమ్‌కు dNTP, Mg2+, పొడిగింపు కారకాలు మరియు యాంప్లిఫికేషన్ మెరుగుదల కారకాల జోడింపును సూచిస్తుంది, పేరెంట్ DNAని టెంప్లేట్‌గా మరియు నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లను పొడిగింపు యొక్క ప్రారంభ బిందువుగా ఉపయోగిస్తుంది , డీనాటరేషన్, ఎనియలింగ్, ఎక్స్‌టెన్షన్ మొదలైన దశల ద్వారా, పేరెంట్ స్ట్రాండ్ టెంప్లేట్ DNAకి కాంప్లిమెంటరీ డాటర్ స్ట్రాండ్ DNAని ఇన్ విట్రో రెప్లికేట్ చేసే ప్రక్రియ విట్రోలో ఏదైనా టార్గెట్ DNAని త్వరగా మరియు ప్రత్యేకంగా విస్తరించగలదు.

1. హాట్ స్టార్ట్ PCR

సంప్రదాయ PCRలో యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క ప్రారంభ సమయం PCR మెషీన్‌ను PCR మెషీన్‌లో ఉంచడం కాదు, ఆపై ప్రోగ్రామ్ విస్తరించడం ప్రారంభమవుతుంది.సిస్టమ్ కాన్ఫిగరేషన్ పూర్తయినప్పుడు, యాంప్లిఫికేషన్ ప్రారంభమవుతుంది, ఇది నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌కు కారణం కావచ్చు మరియు హాట్-స్టార్ట్ PCR ఈ సమస్యను పరిష్కరించగలదు.

హాట్ స్టార్ట్ PCR అంటే ఏమిటి?ప్రతిచర్య వ్యవస్థను సిద్ధం చేసిన తర్వాత, ఎంజైమ్ మాడిఫైయర్ ప్రతిచర్య యొక్క ప్రారంభ తాపన దశలో లేదా "హాట్ స్టార్ట్" దశలో అధిక ఉష్ణోగ్రత వద్ద (సాధారణంగా 90 ° C కంటే ఎక్కువ) విడుదల చేయబడుతుంది, తద్వారా DNA పాలిమరేస్ సక్రియం చేయబడుతుంది.ఖచ్చితమైన క్రియాశీలత సమయం మరియు ఉష్ణోగ్రత DNA పాలిమరేస్ మరియు హాట్-స్టార్ట్ మాడిఫైయర్ యొక్క స్వభావంపై ఆధారపడి ఉంటుంది.ఈ పద్ధతి ప్రధానంగా DNA పాలిమరేస్ యొక్క కార్యాచరణను నిరోధించడానికి యాంటీబాడీస్, అఫినిటీ లిగాండ్‌లు లేదా రసాయన మాడిఫైయర్‌ల వంటి మాడిఫైయర్‌లను ఉపయోగిస్తుంది.గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద DNA పాలిమరేస్ యొక్క కార్యాచరణ నిరోధించబడినందున, PCR ప్రతిచర్యల యొక్క నిర్దిష్టతను త్యాగం చేయకుండా గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద బహుళ PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థలను సిద్ధం చేయడానికి హాట్ స్టార్ట్ టెక్నాలజీ గొప్ప సౌలభ్యాన్ని అందిస్తుంది.

2. RT-PCR

RT-PCR (రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ PCR) అనేది mRNA నుండి cDNAలోకి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ మరియు యాంప్లిఫికేషన్ కోసం టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించడం కోసం ఒక ప్రయోగాత్మక సాంకేతికత.ప్రయోగాత్మక విధానం ఏమిటంటే, ముందుగా కణజాలం లేదా కణాలలో మొత్తం RNAను సంగ్రహించడం, ఒలిగో (dT)ని ప్రైమర్‌గా ఉపయోగించడం, cDNAను సంశ్లేషణ చేయడానికి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌ని ఉపయోగించడం, ఆపై లక్ష్య జన్యువును పొందడం లేదా జన్యు వ్యక్తీకరణను గుర్తించడం కోసం PCR విస్తరణ కోసం cDNAను టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించడం.

3. ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR

ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR (రియల్-టైమ్ క్వాంటిటేటివ్ PCR,RT-qPCR) PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థకు ఫ్లోరోసెంట్ సమూహాలను జోడించే పద్ధతిని సూచిస్తుంది, మొత్తం PCR ప్రక్రియను నిజ సమయంలో పర్యవేక్షించడానికి ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ల సంచితాన్ని ఉపయోగిస్తుంది మరియు చివరకు టెంప్లేట్‌ను పరిమాణాత్మకంగా విశ్లేషించడానికి ప్రామాణిక వక్రతను ఉపయోగిస్తుంది.సాధారణంగా ఉపయోగించే qPCR పద్ధతులలో SYBR గ్రీన్ I మరియు TaqMan ఉన్నాయి.

4. నెస్టెడ్ PCR

నెస్టెడ్ PCR అనేది రెండు రౌండ్ల PCR యాంప్లిఫికేషన్ కోసం రెండు సెట్ల PCR ప్రైమర్‌ల వినియోగాన్ని సూచిస్తుంది మరియు రెండవ రౌండ్ యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తి లక్ష్య జన్యు భాగం.

మొదటి జత ప్రైమర్‌ల (అవుటర్ ప్రైమర్‌లు) అసమతుల్యత వలన నిర్దిష్ట-కాని ఉత్పత్తిని విస్తరించినట్లయితే, అదే నాన్-స్పెసిఫిక్ ప్రాంతాన్ని రెండవ జత ప్రైమర్‌లు గుర్తించి, విస్తరించడం కొనసాగించే అవకాశం చాలా తక్కువగా ఉంటుంది, కాబట్టి రెండవ జత ప్రైమర్‌ల ద్వారా విస్తరణ, PCR యొక్క విశిష్టత మెరుగుపరచబడింది.రెండు రౌండ్ల PCR చేయడం వల్ల కలిగే ఒక ప్రయోజనం ఏమిటంటే, ఇది పరిమిత ప్రారంభ DNA నుండి తగినంత ఉత్పత్తిని విస్తరించడంలో సహాయపడుతుంది.

5. టచ్‌డౌన్ PCR

టచ్‌డౌన్ PCR అనేది PCR సైకిల్ పారామితులను సర్దుబాటు చేయడం ద్వారా PCR ప్రతిచర్య యొక్క నిర్దిష్టతను మెరుగుపరచడానికి ఒక పద్ధతి.

టచ్‌డౌన్ PCRలో, మొదటి కొన్ని చక్రాల కోసం ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత ప్రైమర్‌ల గరిష్ట ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత (Tm) కంటే కొన్ని డిగ్రీల కంటే ఎక్కువగా సెట్ చేయబడింది.అధిక ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌ను సమర్థవంతంగా తగ్గిస్తుంది, అయితే అదే సమయంలో, అధిక ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత ప్రైమర్‌లు మరియు టార్గెట్ సీక్వెన్స్‌ల విభజనను తీవ్రతరం చేస్తుంది, ఫలితంగా PCR దిగుబడి తగ్గుతుంది.అందువల్ల, మొదటి కొన్ని చక్రాలలో, సిస్టమ్‌లోని లక్ష్య జన్యువు యొక్క కంటెంట్‌ను పెంచడానికి ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత సాధారణంగా ప్రతి చక్రానికి 1°C తగ్గేలా సెట్ చేయబడుతుంది.ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత వాంఛనీయ ఉష్ణోగ్రతకి తగ్గించబడినప్పుడు, మిగిలిన చక్రాల కోసం ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత నిర్వహించబడుతుంది.

6. డైరెక్ట్ PCR

డైరెక్ట్ PCR అనేది న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ ఐసోలేషన్ మరియు శుద్దీకరణ అవసరం లేకుండా నమూనా నుండి నేరుగా లక్ష్య DNA యొక్క విస్తరణను సూచిస్తుంది.

డైరెక్ట్ PCRలో రెండు రకాలు ఉన్నాయి:

ప్రత్యక్ష పద్ధతి: PCR గుర్తింపు కోసం ఒక చిన్న మొత్తంలో నమూనా తీసుకొని నేరుగా PCR మాస్టర్ మిక్స్‌కి జోడించండి;

క్రాకింగ్ పద్ధతి: నమూనాను నమూనా చేసిన తర్వాత, దానిని లైసేట్‌కు జోడించి, జీనోమ్‌ను విడుదల చేయడానికి లైస్ చేయండి, కొద్ది మొత్తంలో లైస్డ్ సూపర్‌నాటెంట్‌ను తీసుకొని PCR మాస్టర్ మిక్స్‌లో జోడించండి, PCR గుర్తింపును నిర్వహించండి.ఈ విధానం ప్రయోగాత్మక వర్క్‌ఫ్లోను సులభతరం చేస్తుంది, ప్రయోగాత్మక సమయాన్ని తగ్గిస్తుంది మరియు శుద్దీకరణ దశల సమయంలో DNA నష్టాన్ని నివారిస్తుంది.

7. SOE PCR

అతివ్యాప్తి పొడిగింపు PCR (SOE PCR) ద్వారా జీన్ స్ప్లికింగ్ PCR ఉత్పత్తులను అతివ్యాప్తి గొలుసులను ఏర్పరచడానికి పరిపూరకరమైన చివరలతో ప్రైమర్‌లను ఉపయోగిస్తుంది, తద్వారా తదుపరి విస్తరణ ప్రతిచర్యలో, అతివ్యాప్తి చెందుతున్న గొలుసుల పొడిగింపు ద్వారా, విస్తరించిన శకలాలు అతివ్యాప్తి చెందే సాంకేతికత యొక్క వివిధ మూలాలు మరియు కలిసి విభజించబడింది.ఈ సాంకేతికత ప్రస్తుతం రెండు ప్రధాన అనువర్తన దిశలను కలిగి ఉంది: ఫ్యూజన్ జన్యువుల నిర్మాణం;జన్యు సైట్-నిర్దేశిత మ్యుటేషన్.

8. IPCR

విలోమ PCR (IPCR) రెండు ప్రైమర్‌లు కాకుండా ఇతర DNA శకలాలను విస్తరించడానికి రివర్స్ కాంప్లిమెంటరీ ప్రైమర్‌లను ఉపయోగిస్తుంది మరియు తెలిసిన DNA ఫ్రాగ్‌మెంట్‌కి రెండు వైపులా తెలియని సీక్వెన్స్‌లను పెంచుతుంది.

IPCR వాస్తవానికి పక్కనే ఉన్న తెలియని ప్రాంతాల క్రమాన్ని గుర్తించడానికి రూపొందించబడింది మరియు ఎక్కువగా జన్యు ప్రమోటర్ సీక్వెన్స్‌లను అధ్యయనం చేయడానికి ఉపయోగించబడుతుంది;జీన్ ఫ్యూజన్, ట్రాన్స్‌లోకేషన్ మరియు ట్రాన్స్‌పోజిషన్ వంటి ఆంకోజెనిక్ క్రోమోజోమ్ పునర్వ్యవస్థీకరణలు;మరియు వైరల్ జీన్ ఇంటిగ్రేషన్, సాధారణంగా ఇప్పుడు ఉపయోగించబడుతుంది సైట్-డైరెక్ట్ మ్యూటాజెనిసిస్ కోసం, కావలసిన మ్యుటేషన్‌తో ప్లాస్మిడ్‌ను కాపీ చేయండి.

9. dPCR

డిజిటల్ PCR (dPCR) అనేది న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ అణువుల సంపూర్ణ పరిమాణీకరణకు ఒక సాంకేతికత.

న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ అణువుల పరిమాణీకరణకు ప్రస్తుతం మూడు పద్ధతులు ఉన్నాయి.ఫోటోమెట్రీ అనేది న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ అణువుల శోషణపై ఆధారపడి ఉంటుంది;నిజ-సమయ ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR (రియల్ టైమ్ PCR) Ct విలువపై ఆధారపడి ఉంటుంది మరియు Ct విలువ గుర్తించదగిన ఫ్లోరోసెన్స్ విలువకు సంబంధించిన సైకిల్ సంఖ్యను సూచిస్తుంది;డిజిటల్ PCR అనేది న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ పరిమాణాన్ని లెక్కించడానికి సింగిల్-మాలిక్యూల్ PCR పద్ధతిపై ఆధారపడిన తాజా పరిమాణాత్మక సాంకేతికత ఒక సంపూర్ణ పరిమాణాత్మక పద్ధతి.